“我们提供了分辨率达到 2.9 埃的高清结构图，解释了关于大肠杆菌胞苷三磷酸合成酶的疑问，为开发针对这种酶的物种特异性的小分子抑制剂和激动剂、以及开发新型抗生素提供了思路。”上海科技大学刘冀珑教授表示。

图 | 从左到右：刘冀珑、郭陈君、汪紫璇（来源：课题组）

研究中，他和团队展示了大肠杆菌胞苷三磷酸合成酶纤维、与大肠杆菌胞苷三磷酸、还原型辅酶 Ⅰ 和共价抑制剂 6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸（DON，6-diazo-5-oxo-L-norleucine）的 2.9Å 冷冻电镜结构。

并对其结构进行了全面分析，针对大肠杆菌胞苷三磷酸合成酶纤维的形成提供了基于进化视角的解读。

通过结构分析和生化测定，课题组也揭示了还原型辅酶 Ⅰ 和腺嘌呤，对于大肠杆菌胞苷三磷酸合成酶的协同抑制作用。

大肠杆菌胞苷三磷酸合成酶，是许多不同疾病的潜在药物靶点。而该团队通过分析表明：α- 螺旋 12 是真核大肠杆菌胞苷三磷酸合成酶的一个更具特征的特征。

并表明：当将这种螺旋插入大肠杆菌胞苷三磷酸合成酶，会使其像人类大肠杆菌胞苷三磷酸合成酶一样在底物结合状态下形成纤维。

此外，课题组还获得了具有共价结合的 DON、大肠杆菌胞苷三磷酸、还原型辅酶 Ⅰ 的大肠杆菌胞苷三磷酸合成酶的冷冻电镜结构。

在应用前景上：

未来，可以针对原核生物进行广谱性的抑制，由于不会对真核生物产生影响，因此可以设计新的抗生素。

此外，目前他们已经生成高分辨结构图，因此可以针对特别物种进行激活或抑制。

同时，针对代谢酶细胞蛇的特性，可以对代谢酶进行修改加工。

即利用它们能够形成细胞蛇和形成纤维的特性，拓展开发新型材料。目前，该实验室已有数名组员在开展这方面的研究。

首创生物名词“细胞蛇”，回国之后积极拥抱冷冻电镜

详细来说，本次课题主要研究了大肠杆菌中一个合成酶的代谢酶的结构。

如前所述，它的名字叫做大肠杆菌胞苷三磷酸合成酶（CTPS，Cytidine triphosphate synthase）。

据了解，脱氧核糖核酸 DNA 和核糖核酸 RNA 都是长链分子，它们均由少数几个核苷酸排列组合而成。

组成 RNA 的四个基本的核苷酸分别是：

• 三磷酸腺苷（ATP，Adenosine triphosphate）；
• 三磷酸尿苷（UTP，Uridine triphosphate）；
• 三磷酸鸟苷（GTP，Guanosine triphosphate）；
• 三磷酸胞苷（CTP, Cytidine triphosphate）。

CTPS 负责催化核苷酸 CTP 从头合成的最后一步，它能够将 UTP 和 ATP 作为底物生成 CTP。

在这一催化反应中，另一种核苷酸——三磷酸鸟苷，能对上述反应起到强有效的调节作用。这样一来，所有四个基本核苷酸都可以和 CTPS 结合。

因此，CTPS 也是被生物化学领域研究得非常透彻的一个酶。自 20 世纪 50 年代首次被研究以来，它已经成为生物化学教材中的经典酶之一。

通过研究 CTPS 人们得出了很多经典的生物化学概念。以酶和底物之间的相互调节这一概念为例，正是把 CTPS 作为作为范例。

虽然关于这方面的生物化学研究已有很多，但是学界尚未关注 CTPS 在细胞内部的分布。

2007 年，刘冀珑开始在牛津大学任教，并开始使用果蝇作为研究的模式生物。

2010 年的 5 月，刘冀珑在一篇论文中报道称在果蝇中的 CTPS 可以形成长条状的结构。

由于这个结构在光学显微镜下看起来非常像蛇，所以刘冀珑给它命名为“cytoophidium”（复数是“cytoophidia”）。

这个词是从希腊语而来，“cyto”是“细胞”的意思，“ophidium”是蛇的意思，“cytoophidium”的中文意思便是“细胞蛇”。

2010 年 7 月到 8 月之间，来自美国的另外两个课题组分别报道了 CTPS 在细菌和酿酒酵母里能够形成类似的纤维状结构。

从那以后，越来越多的科学家开始关注下面两个科学问题：类似于 CTPS 这样的代谢酶如何形成细胞蛇？细胞蛇在细胞里面到底发挥什么作用？

从 2010 年刘冀珑发表第一篇细胞蛇论文以来，细胞蛇领域逐渐走入初期阶段。

而到了 2024 年5月，在生物医学文献库 Pubmed 搜索关键词“cytoop*”（包含细胞蛇英文的单数和复数）可导出 95 篇论文，其中 62 篇论文来自刘冀珑课题组和合作者。

2016 年，刘冀珑实验室从牛津大学搬到上海科技大学。回国以后，他和团队的一个重要方向是利用冷冻电镜技术，来探索 CTPS 与不同配体结合之后的近原子水平的高分辨率结构。

2016 年，郭陈君同学进入上海科技大学读本科，当时刘冀珑是他的导师。大二下学期，郭陈君来到刘冀珑实验室实习。

那时，刘冀珑给他布置了一项任务：利用冷冻电镜来理解细胞蛇和代谢纤维的结构。

2019 年，该团队发现果蝇 CTPS 能够结合底物或者结合产物形成两种构象不同的纤维，借此发表了课题组第一篇结构生物学论文。

这也让他们初步认识到冷冻电镜的威力，但是所获得的分辨率还是不够好。当时，他们的目标是希望分辨率达到 4 埃。

2021 年，他们解析了果蝇 CTPS 与不同配体结合的结构，分辨率达到 2.5 埃。

之前，该团队对于果蝇 CTPS 的研究，和部分同行对于酵母菌和大肠杆菌 CTPS 的研究秉持不同观点。

于是，业内有人提出：CTPS 在原核生物与真核生物的拥有不同的调控模式。

但是，这样的解释让刘冀珑觉得并不完美，所以他想做得更加细致一些，并开始选择大肠杆菌 CTPS 作为研究对象，于是便开始了本次研究。

历时 70 多年，CTPS“宝藏”依旧待挖

总的来说，本次研究拥有三个亮点，解释了此前生物化学方法已发现的、但是不能解释清楚的现象。

本次成果的第一个亮点是：CTPS 与共价抑制剂 DON 的结合。

即 CTPS 可以共价连接一种名为 DON 的抑制剂（DON 是一个谷氨酰胺的类似物）。

当 DON 与 CTPS 结合之后，可以把酶的两个结构域中的其中一个锁死。

早在 1971 年，就有学者发现当原核生物 CTPS 在结合 DON 之后，还可以利用氨发生反应。

但是，氨气是从哪进入酶结构域里面的氨气通道的？对于这一问题人们始终弄不清楚。

刘冀珑说：“我们常说眼见为实。对于代谢酶来说，虽然学界做了很多生物化学实验，但假如没有一个结构的话，就会有雾里看花的感觉。”

而在本次研究之中，该团队获得了大肠杆菌 CTPS 结合 DON 的结构。

由于本次分辨率达到 2.9 埃，通过此他们发现该结构存在一个孔洞，但是和领域内的经典孔洞并不一样。

具体来说：这个孔洞可以让氨气进入到氨气通道，而这个通道可以让氨气扩散到另外一个结构域进而发生反应。

也就是说，本次研究可以从结构上来解释，到底 DON 结合后的 CTPS，是如何让氨气进入氨气通道、以及又是如何发生反应的。

本次成果的第二个亮点是：CTPS 与 CTP 的结合。

CTP 是 CTPS 催化的反应产物。该课题组曾在真核生物果蝇里，首次发现 CTPS 有两个 CTP 结合位点。其他课题组则在原核生物里发现只有一个 CTP 结合位点。

而该团队通过本次工作证实：大肠杆菌 CTPS 只有一个结合位点。

而课题组所拥有的高分辨率电子密度图，让他们得以有能力开展相关的计算。

借此发现：大肠杆菌 CTPS 对应的真核生物 CTP 结合的第二个位点位置口袋太小，因此无法装下第二个 CTP。

本次成果的第三个亮点是：CTPS 与还原型辅酶 Ⅰ 的结合。

2016 年，有学者发现还原型辅酶 Ⅰ 可以结合 CTPS 上面。但是，怎么结合？结合在哪儿？对此人们依旧不清楚。

而该团队在本次研究之中，成功解析了 CTPS 和还原型辅酶 Ⅰ 的结合结构。

期间，他们把 DON、CTP 和还原型辅酶 Ⅰ 这三个不同的配体，与大肠杆菌 CTPS 加以结合。

借此取得了接近原子水平的高分辨率的结构，为一些悬而未决的关键问题提供了结构基础。

此外，他们还从进化角度出发，对比了原核生物和真核生物 CTPS 形成代谢纤维的界面。

通过此，他们发现真核生物 CTPS 中的 α- 螺旋 12，在原核生物的大部分物种的 CTPS 中处于缺失状态。

为此，他们还进行了一些实验，结果发现 α- 螺旋的确可以影响纤维结构。

另据悉，在本次研究中他们也使用了 AlphaFold2，借此设计出一个融合人类蛋白片段的原核 CTPS 蛋白。

相较于传统方法，AlphaFold2 不仅简单易用，并能给出较为准确的结果。

最终，相关论文以《配体对原核 CTP 合成酶的纤维化和抑制作用》（Filamentation and inhibition of prokaryotic CTP synthase with ligands）为题作为封面论文，发表在微生物领域学术期刊 mLife[1]。

上海科技大学的博士生郭陈君和本科生汪紫璇是共同一作，上海科技大学教授刘冀珑担任通讯作者。

图 | 相关论文（来源：mLife）

此外，刘冀珑表示：“我相信，研究细胞蛇和代谢纤维将能带来很多启示作用。”

该团队的郭陈君也表示：“CTPS 是一座宝矿，虽然已经被研究了 70 多年，但是仍有许多关键的问题没有得到准确的回答。”

后续，他们打算进一步深挖机理，以及利用已有知识设计一些具有应用价值的特异性抑制剂和激动剂。

参考资料：

[1] Guo C, Wang Z, Liu J-L. 2024. Filamentation and inhibition of prokaryotic CTP synthase with ligands. mLife 3(2). https://doi.org/10.1002/mlf2.12119

运营/排版：何晨龙